病毒采样管内保存液的配置及使用方法

2022-04-19 08:39:42

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①制作病毒采样管内保存液时先称取142．14gTris置于烧杯，加入750mL蒸馏水，磁力搅拌器搅拌溶解均匀，然后加入盐酸调pH至7．6，定容到1L，配成1mol/L的Tris-HCL(pH7．6)。

②称取186．0g乙二胺四乙酸二钠二水合物置于烧杯，加入750mL蒸馏水，然后加入氢氧化钠调pH至7．6，定容到1L，配成0．5mol/L的EDTA。

③称取20．0g月桂酰肌氨酸置于烧杯，用蒸馏水缓慢搅拌溶解(泡沫较多)，定容至100mL，配置20%的月桂酰肌氨酸溶液。

④将90mL蒸馏水、10．6mL1mol/LTris-HCL(pH7．6)、4．2mL0．5mol/L的EDTA、100g异硫酸氰胍置于烧杯中。50℃加热搅拌1h直至完全溶解。

⑤待上述溶液完全溶解，再加入21．1mL20%的月桂酰肌氨酸、2．12mL的β-巯基乙醇，搅拌均匀，放于4℃保存(4℃保存较长时间会出现晶体析出，但不影响使用效果，在使用一次性病毒采样管内保存液前加热融化即可)。

PCＲ体系中样本浓度与Ct值的线性关系取66．6μLN基因假病毒(初始浓度为1×108copies/mL)，用病毒采样管提取ＲNA，最终用30μLDEPC水洗脱。取9μL纯化的ＲNA模板加入终体积为20μL的PCＲ反应体系。根据换算可知，反应体系中的假病毒终浓度为1×108copies/mL(忽略核酸提取过程中的损失)。将N基因假病毒以10倍梯度稀释，使PCＲ反应体系中假病毒终浓度梯度如下:1×107、1×106、1×105、1×104及1×103copies/mL，每个梯度做3组平行。反应体系20μL:FastVirus1-StepMasterMix5μL、上下游引物及探针各0．4μL、DEPC水4．8μL以及模板9μL。扩增程序:25℃2min;50℃15min;95℃2min;95℃15sec，60℃45sec，45个循环，在60℃时采集荧光信号。

病毒采样管.jpg