新型冠状病毒核酸检测步骤

一、具体操作如下

1.病毒采样:取病人睡液或者鼻咽拭子病毒采样管保存.常用的病毒管中病毒保存液分灭活型与非灭活型.以下为病毒保存液的两种型号:

1)灭活型:灭活病毒保存液的颜色为透明的.它的特点是可以杀死病毒，保留核酸片段.一般用来检测新型冠状病毒、流感病毒、手足口病毒及甲乙流感等

2)非灭活型:非灭活病毒保存液不含裂解液. 可保留病原体的活性与完整性，颜色为粉红色.它主要应用于病毒的培养和繁殖，使检测结果更精准

2.核酸提取:提取病人睡液或者鼻咽拭子样本里的遗传物质，如果病人携带病毒.则样本里就会有该病毒的遗传物质RNA，使用硅胶柱离心、磁性硅胶颗粒分离方法以及自动化仪器等商品化试剂或设备并按说明书操作。提取RNA时应注意防止RNA降解。DNA应置于-20℃保存.RNA和需长期保存的DNA应置于-70℃或液氮保存。

3.逆转录合成cDNA:进行提取液中RNA的逆转录，把RNA逆转录成cDNA逆转录cDNA合成反应击使用逆转录引物、dNTPs、逆转录酶、RNA酶抑制剂、DTT.缓冲液和适量无RNA/DNA酶的超纯水以及RNA模板.在扩增仪或水浴箱中，在规定的温度和时间下进行逆转录反应。建议使用商品化RT-PCR一步法试剂进行di一轮扩增反应。逆转录cDNA合成反应需使用逆转录引物、dNTPs、逆转录酶、RNA酶抑制剂、DTT、缓冲液和适量无RNA/DNA酶的超纯水以及RNA模板。在扩增仪或水浴箱中，在规定的温度和时间下进行逆转录反应.使用商品化RT-PCR一步法试剂进行di一轮扩增反应。

4. PCR扩增反应(使用二次扩增的套式PCR扩增方法):用病毒cDNA的特异性引物进行PCR扩增PCR反应需使用引物、dNTPs. DNA聚合酶(如Taq酶等)、缓冲液、和适量无RNA/DNA酶超纯水、以及模板(DNA或cDNA).在扩增仪中.按照设定的程序进行扩增。使用二次扩增的套式PCR扩增方法.

5.结果分析判定:

若有扩增出病毒的DNA条带，则判定病人体内有该病毒；若没有扩增出DNA条带.则判定病所取样本无该病毒。

二、实验注意事项:

①每一次检测需同时做两个阳性对照、两个阴性对照，只有阳性对照扩增出预期的片段、阴性对照没有扩增出任何片段、双份平行样品结果一致的情况下实验才成立.可以作出核酸阳性或阴性反应结果的判定。

②核酸检测阳性:发现核酸阳性反应.应该重复采集样品进行复测，复测结果是核酸阳性反应则判定为核酸阳性，复测结果为核酸阴性反应则判为不确定